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Advanced Science | circ-MALAT1同時抑制蛋白翻譯和競爭結合miRNA
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-04-14 | 226 次瀏覽 | 分享到:
2019年12月21日,俄克拉荷馬大學Chuanbin Mao海第四人民醫院/長海醫院善榮教授為共同通訊作者在ADVANCED SCIENCE (IF= 15.804)雜志上發表了一篇題為“Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA Translation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells”的文章,報道在肝癌腫瘤干細胞(CSC)中發現了高表達的環狀RNA,circ-MALAT1。該分子通過兩種方式發揮功能:一方面,circ-MALAT1通過海綿miRNA(miR-6887-3p)上調癌基因(JAK2)和增加磷酸化JAK2,增強JAK2/STAT3信號通路,從而積極地促進CSC的自我更新:另一方面,circ-MALAT1可以通過抑制mRNA翻譯過程,直接抑制PAX5 mRNA的翻譯,這種mRNA Translation Brake是一種全新的circRNA功能機制形式,值得關注([1])。


肝癌是我國高發的,危害極大的惡性腫瘤。它的發生與腫瘤干細胞無限制的增殖有著密不可分的聯系。腫瘤干細胞(Cancer stem cell,CSC)具有無限制自我更新和分化的特性,被認為是腫瘤發生、發展和轉移的起源。高比例的CSC可以加速腫瘤轉變成癌癥,其對治療還有強烈的抗性,這也是導致癌癥發生的主要原因。目前有研究表明,circRNA在腫瘤的發生、發展和轉移中有潛在的作用。雖然CSC和circRNA均與腫瘤的發生和發展有聯系,但是circRNA在這方面是如何調控CSC的還不清楚。

原發性肝癌的腫瘤干細胞和粘附細胞circRNA的表達差異和驗證

作者首先從患者實體瘤中分離出原發性肝癌(HCC)細胞,并通過懸浮培養獲得CSC,之后,在5對HCC腫瘤組織(5例CSC和5例粘附細胞),利用高通量的CircRNA-seq技術,檢測出circRNA轉錄本的表達差異。相比于對照細胞,18個circRNA在CSC中特異表達,根據表達差異倍數選取9個circRNA進行驗證。設計circRNA的convergent primers和 divergent  primers,根據其在cDNA和基因組DNA的擴增結果,來證實9個circRNAs為環狀。此外,進行RNase R處理的反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)進一步證實了上述結果。由于circ-MALAT1在CSC和粘附細胞的表達量最高,因此選擇進行進一步研究。


圖1 肝癌干細胞中circ-MALAT1表達鑒定 ([1]



circ-MALAT1促進了肝癌CSC的自我更新

作者通過向Hep3B細胞系與Huh7細胞系中轉染circ-MALAT1質粒過表達circ-MALAT1。在Hep3B細胞系中,circ-MALAT1過表達細胞形成了更多的原代、次級和三級懸浮球體。更重要的是,作者評估了穩定過表達circ-MALAT1的Huh7細胞移植瘤的生長情況。體內注射過表達circ-MALAT1的細胞導致比對照細胞更大的腫瘤尺寸、更高的腫瘤重量和更快的腫瘤生長速度。


圖2 circ-MALAT1與CSC干性的關系 ([1]



circ-MALAT1促進了CSC的自我更新的潛在機

為了了解circ-MALAT1調節肝細胞CSC自我更新的機制,作者重點研究了circ-MALAT1相關的下游蛋白。對原發性肝癌的CSC進行蛋白芯片檢測,有224個蛋白質上調,43個蛋白質下調。在224個上調蛋白中,96個蛋白與CSC自我更新或腫瘤轉移和增殖相關。43個下調的蛋白質中有10個與腫瘤抑制相關。WB結果顯示,在Hep3B中,過表達circ-MALAT1會使janus-activated kinase 2 (JAK2)表達顯著升高和Paired box 5 (PAX5)表達顯著下降。在原發性HCC或者HCC細胞系中,均顯示CSC相比較于對照細胞,JAK2的表達高,PAX5的表達低。綜上所述,這些結果強烈表明circ-MALAT1可導致肝臟CSC中JAK2上調和PAX5下調。分別對這兩個通路進一步探索。


圖3 circ-MALAT1調控CSC干性的機制 ([1]



circ-MALAT1、核糖體和PAX5形成三元復合物來阻止PAX5的翻譯

作者通過FISH發現circ-MALAT1定位在細胞質中,它的過表達并不會影響PAX5的mRNA水平,其對PAX5的作用發生在轉錄后水平。circ-MALAT1上有兩個IRES和一個含有11個堿基的區域。RIP、qRT-PCR、RNA pull down、IRES和11個堿基突變實驗證實了circ-MALAT1分別通過IRES和11個堿基與核糖體和PAX5 mRNA 形成三元復合物來阻止PAX5的翻譯,并且這種結合具有序列特異性。


圖4 circ-MALAT1作為mRNA Brake抑制PAX5翻譯 ([1]



circ-MALAT1-miR-6887-3p-JAK2軸促進腫瘤干細胞的自我更新

另一方面,作者對JAK2這一通路進行探索,通過對circ-MALAT1和JAK2共同作用分子的預測及其驗證,發現了circ-MALAT1可以下調miR-6887-3p,進而去抑制了它的靶標JAK2。WB檢測JAK2其相關通路蛋白,JAK2/STAT3信號通路中的三個關鍵蛋白分子JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)和磷酸化STAT3(p-STAT3)也被證實在CSC中上調。進一步的移植瘤實驗中過表達/敲低miR-6887-3P會使JAK2表達量下降/上升和移植瘤生長減慢/加快。以上實驗得出,CSC中circ-MALAT1的上調可以抑制miR-6887-3p,從而增強JAK2/STAT3途徑的活性,促進CSC的自我更新。


圖5 circ-MALAT1通過抑制miR-6887-3p表達,調控JAK2/STAT3途徑 ([1]
圖6 體內實驗驗證circ-MALAT1競爭性結合miR-6887-3p ([1]
參考文獻
1. Chen, L., et al., Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA Translation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells. Adv Sci (Weinh), 2020. 7(4): p. 1900949.
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